猫血清淀粉样蛋白ASAA作为炎症标志

作者：KimikazuSASAKI，ZhiyongMA，Tanvir.S.KHATLANI，MasaruOKUDA，HisashiINOKUMAandAkafumiONISHI

摘要

采用直接酶联免疫吸附法（ELISA)测定猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）浓度,用fSAA特异性单克隆抗体，评价fSAA作为猫炎症标志物的作用正常猫（n=45）和各种疾病猫（n=）血清fSAA的平均浓度±标准差分别为0.60±1.06μg/ml和33.65±67.59μg/ml。两组比较有显著性差异（p0.）。还发现，fSAA的浓度在节育手术后约3～6小时开始迅速增加，并且继续增加。在某些疾病，如损伤、肾衰竭、传染病等中高达显著水平。

急性期反应是对炎症刺激（如感染，创伤，肿瘤和手术）的初始反应。这种反应的一个特征是肝脏中血浆蛋白异质组的合成增加，这些蛋白称为急性期蛋白，包括C反应蛋白（CRP），血清淀粉样蛋白A（SAA），触珠蛋白和α1-酸糖蛋白等。CRP和SAA是人类主要的急性蛋白，在炎症刺激下血清浓度显着增加，因此已被用作人类医学中的炎症标志物。

高度保守的SAA基因和蛋白质是通过真核哺乳动物的进化得以维持的，这进一步证明了它们可能具有重要的生物学功能。SAA是高密度脂蛋白3复合物的主要组成部分，其正常生理功能尚不清楚，尽管它被认为在炎症过程中具有关键但定义不清的保护作用。

在人类和其他物种的炎症性疾病中，血浆SAA水平可以增加到基础水平的倍，这表明它是疾病状态的一个重要指标。然而，猫科动物SAA（fSAA）能否作为炎症标志物还没有得到很好的评价。早些时候，我们已经表达了重组猫科动物SAA（rfSAA），并产生了fSAA特异性单克隆抗体。这些材料为我们评估fSAA是否可以作为猫的炎症标志物提供了一个思路。为了测量SAA的浓度，有很多检测方法，如激光免疫比浊法、血小板凝集比浊法、夹心酶联免疫吸附法（ELISA）、单放射免疫扩散法，非竞争性化学发光酶免疫分析和直接ELISA已在人类和其他物种中得到发展。然而，猫体内SAA浓度的测定方法尚未开发出来。我们认为，直接ELISA是一种快速、简便的方法，可用于临床常规诊断和临床管理。因此，建立了一种直接ELISA法，并将其用于评价猫nesaa作为炎症标志物的作用。对直接ELISA的关键因素如ELISA平板类型、血清稀释液的组成、包衣时间和包衣温度、血清稀释率、封闭缓冲液的类型等进行了优化，并建立了如下模型。在含有1%明胶的PBS－T（磷酸盐缓冲盐水中含有0.05%吐温20）稀释血清样品，并在37℃下在37℃的NUNC免疫MaxISORPTMTM板（NalgNuncInternational，丹麦）上涂覆4小时。用horseradishperoxidase（HRP）结合的单克隆抗体fSAA（Boeer-Ranger-Mangnim-BioCiCiCa，德国）在37°C下培养1小时，用PBS.T洗涤4次后，再将培养皿洗涤3次。通过添加ABTS微孔过氧化物酶底物（Kikkgad和PrRy实验室，盖瑟斯堡，美国）开始反应，并在双色微板读数仪上测定nm处的吸光度。为建立测定fSAA的标准曲线，将纯化后的rfSAA连续稀释使用。基于标准曲线的fSAA浓度的有效范围为0.34至μg/ml。血清样品的SAA浓度由该标准曲线计算。

从患有各种疾病的猫和临床正常的猫身上采集血清样本。血清在使用前保存在-20°C。从临床健康的猫身上获得的血清样本被视为正常血清样本。正常血清样品（n=45）中fSAA的浓度范围为≤0.34～3.6μg/ml，平均浓度±标准差（SD）为0.60±1.06μg/ml并用直接ELISA法对各种疾病进行了检测。血清fSAA的浓度范围（n=）为≤0.34～μg/ml，平均值±标准差（SD）为33.65±67.59μg/ml，韦尔奇试验结果表明，正常血清与不同疾病猫血清有显著性差异（p0.）。根据正常血清样本的浓度，采用以下公式计算出的阳性截止值暂时估计为3.79微克/毫升：平均值+3SD（图1）。正常猫血清中fSAA的浓度为0.60±1.06μg/ml，与夹心ELISA检测的16.6±11.4μg/ml和放射免疫扩散检测的74.4±23.2μg/ml不同[2]。在人类中也有类似的结果，其中，正常血清样品中SAA的平均浓度范围为0.05微克/毫升到2.5微克/毫升，通过不同的方法检测。不同报告中结果的差异可能是由于使用不同的检测方法和所用抗体的特异性。

在不同疾病猫血清样本中，损伤（n=46，61.63±97.48μg/ml，图2）、肾功能衰竭（n=75，30.98±55.67μg/ml，图2，下同）和感染性疾病（n=48，47.22±86.40μg/ml）与正常对照组比较有显著性差异（p0.）。猫下尿路疾病（n=27，27.99±62.59μg/ml）、肿瘤（n=24，16.57±28.40μg/ml）和糖尿病（n=6，7.85±4.37μg/ml）的血清样本与正常对照组比较差异有显著性（p0.05）。相比之下，肠炎（n=9，40.18±82.72微克/毫升）、口腔疾病（n=14，2.90±4.25微克/毫升）和肝脏疾病（n=21，13.90±31.28微克/毫升）与正常样本没有差异。这些结果表明，fSAA可能是一个有用的标记物，对某些疾病和疾病，但不是所有的。肠炎组、口腔疾病组、肝脏疾病组与正常对照组无显著性差异。这可能是因为紊乱的肝脏对包括SAA在内的急性蛋白的合成产生了负面影响。对于肠炎和口腔疾病组，需要更多的血清样本和更详细的分类，以便研究这些疾病中fSAA浓度的变化，使结果更加明确。

为测定SAA的反应时间，对健康猫（n=3）在全身麻醉下进行节育手术手术前后的血清进行了评价。SAA的浓度在约3～6小时开始增加，在手术后约21～24小时达到峰值（图3）。这一结果与先前的报告一致，表明fSAA对炎症刺激反应迅速，因此可以作为指示炎症反应的有用标记物。

据报道，SAA对人类和某些动物的炎症性疾病反应迅速，它也可以作为指示猫的某些炎症性疾病状况的有用标记。我们发现fSAA的浓度在节育手术后约3～6小时开始迅速增加，在某些疾病中，如损伤、肾衰竭、感染性疾病、猫下尿路疾病、肿瘤和糖尿病等，增加到显著的高水平。这些阳性结果将有助于深入研究fSAA作为炎症标志物在各种疾病中的作用。

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