脂肪酸的测定上海液质检测

一、概述

在评价动、植物脂类品质时往往还需要鉴定其脂肪酸组成及其有关理化特性。

在植物油脂中，脂肪酸的种类很多，有的种子和果实中所含的脂肪以饱和脂肪酸为主，有的则以不饱和脂肪酸为主。

饱和脂肪酸，其结构式中不含双键，一般分子式为CnH2n+1COOH或CnH2nO2，如表16-1中软脂酸（C16∶o）、硬脂酸（C18∶0）。饱和脂肪酸营养价值较高，因其所含的热能较高。

不饱和脂肪酸在空气中容易被氧化而变干，愈不饱和的脂肪酸，愈容易氧化，它们这种性质有极大的工业上应用价值。

动、植物油脂的营养价值取决于脂肪酸的组成和含量。脂肪酸不具有吸光能力，也无适当的呈色试剂。所以，不宜用液相色谱法分析。相反，脂肪酸分子中碳原子含量多，故气相色谱法检出灵敏度高。由于这些理由，脂肪酸就成为气相色谱法最初的分析对象。

脂肪酸因其本身具有挥发性，所以能够直接作为气相色谱法的试样。但一般是使之成为挥发性更强的衍生物，通常要转变成甲酯，而后进行分析。

二、气相色谱法

1.三氟化硼法制备脂肪酸甲醋

方法原理

将甘油酯和磷酯皂化，释放出脂肪酸并在BF3催化剂存在下酯化，再以红外光谱（IR）法或气相色谱（GC）法进行分析。

本法适合分析常见动植物油脂和脂肪酸。不可皂化的物质除不去，而且如果它们大量存在，可能会对以后分析产生干扰。

脂肪酸若含大量环氧基、过氧基、醛基、酮基、环丙基和丙烯基，及共轭多不饱和酸和炔属化合物的甲酯，用本法处理不适宜，因为上述基团会部分或全部破坏。

主要仪器：

反应烧瓶————50mL和mL烧瓶，带磨口外接头。冷凝器——水冷回流式，有20～30cm保护套和带磨口的内接头。

试剂

（1）三氟化硼试剂。称BF3g溶于1L甲醇中。常用市售产品或用下面方法制备在2L的烧瓶内加1L甲醇，称重。放在冰水浴上冷却，然后通过玻璃管，使钢瓶中BF3鼓泡加入甲醇中直至BF3g全被吸收为止。在操作完结前，玻璃管中必须仍有BF3通过，把玻璃管脱离甲醇液面，再关钢瓶阀门，以防甲醇倒流入气体阀门内。BF3气体流速不能太快，以至于来不及吸收从而烧瓶中冒出白烟。本试剂在2年内是稳定的（注意∶操作必须在通风柜中进行，以防BF3；的白烟逸出，避免与皮肤、眼睛和呼吸器官接触）。

（2）0.5mol·L-1氢氧化钠甲醇溶液。溶解NaOH2g在含水量≤5%的甲醇mL中，长期放置所生成的Na2CO3沉淀可忽略不计。

（3）庚烷。其纯度应在用气相色谱测定后无杂峰。如果样品中不含≥20个碳原子的脂肪酸则可用己烷来代替。

（4）甲基红溶液。用mL·L-

的乙醇配制1g·L-

甲基红溶液。

（5）氮气。其含氧量5mg·kg--。

对于新批号的试剂务必进行检验，特别是对于BF3，检验的方法是用其与纯油酸甲酯处理和进行色谱分析，如果在色谱图上C20与C22脂肪酸甲酯之间出现额外的峰。就应该不用这批BF3试剂。

样品制备

酯化操作需在通风橱内操作。所有玻璃器皿用后马上清洗。如脂肪酸所含双键数多于2个，则通几分钟氮气，以赶去甲醇和烧瓶中的空气。应尽快分析甲酯，如果不能立即分析，脂肪酸甲酯的庚烷溶液样品在氮气保护下存放在冰箱中。为了延长保存时间，可密封在安瓿中，并保存在冰箱内，或加0.%2，6-二叔丁基-4-甲基酚（BHT）。进行红外分析时，必须尽可能除去溶剂；进行气相色谱分析时，5%～10%溶液是合适的。

精确称取某一样品重量是不必要的。称取样品量的大小仅是为了决定采用多大的酯化瓶和试剂用量。这可按照下表所列相应量进行制备操作（油脂样品用量约mg是较为适宜的）。

（1）脂肪和油脂样品。将样品加到烧瓶中，然后加入NaOH甲醇液和数粒沸石，接上冷凝管进行加热回流至脂肪球消失为止（一般需5～10min）。用洗耳球由移液管或自动吸液器吸入BF3溶液，经冷凝管加入酯化瓶。继续沸腾2min，又通过冷凝管加庚烷2～5ml，再煮1min，移去热源，然后冷却，并加入饱和盐水溶液几毫升，慢慢旋转酯化瓶数次，再加饱和盐水溶液数毫升，以促使脂肪酸甲酯庚烷溶液上升至瓶颈口，吸出1mL此庚烷提取液至气相色谱样品小瓶中，并加入稍许无水硫酸钠，以除去少量的水分。如果浓度过大，可加以稀释至浓度为5%～10%供气相色谱测定用。

（2）脂肪酸样品。加入脂肪酸样品于烧瓶中，然后加BF溶液，按上述（1）回流煮沸2min。

2.气相色谱法测定脂肪酸甲酯（AOAC-IUPAC法）

方法原理

气相色谱法可应用于动植物油脂中含有八至二十四个碳原子的脂肪酸甲酯分离和测定。但此法不适用于含有环氧化基团、氧化了的、聚合的脂肪酸样品的测定。

主要仪器

配备有氢火焰离子化鉴定器的气相色谱仪一台。操作使用条件如下∶

（1）气相色谱仪。气化室部分应具有最小的死体积，其温度应高于柱温20～50℃。色谱柱箱的温度至少在℃下，其温度变动范围应在±1℃。在采用程序升温时，推荐使用双柱技术。

（2）色谱柱。柱长1~3m×2～4mm（内径）的玻璃或不锈钢柱。当样品中含有多于三个双键的不饱和脂肪酸组成时，不宜使用不锈钢柱当样品中含有多于20个碳原子数的长键脂肪酸时，使用短柱为宜。

（3）色谱柱的配制。所用担体是经酸洗硅烷化的硅藻土。其颗粒大小为～ym（60～70筛目）。所选用的担体平均颗粒大小与色谱柱的内径成反比，与柱长成正比。在担体上涂有5%～20%聚酯类型的极性液体，如丁二酸二乙二醇聚酯（DEGS）、丁二酸丁二醇聚酯（BDS），已二酸乙二醇聚酯（EGA）等。

色谱柱老化时，将其与鉴定器连接端脱开。在柱温℃，载气流速20～60mLmin二，老化16h后再升高柱温至℃，老化2h。老化温度可随着所选用的固定液面改变。

（4）微量注射器。最大体积为10μL，最小刻度为0.1μL。

（5）记录器。其满刻度为0～2.5mV或5.0mV，时间响应速率小于1.5s（指当瞬间输入%信号时，记录笔从零到满刻度的90%所需的时间）。记录纸宽度25cm，纸速25～cm*h*l。记录器需配有衰减调节开关。如果使用数字积分仪，其必须有足够的灵敏度，线性的响应范围和满意的基线校正性能。

试剂

（1）载气。干燥的氮、氩气均可，其氧含量应10mg·kg-l。

（2）其他气体。氢气其纯度应达到99.9%，不含其它有机不纯物。空气或氧气，其中碳氢化合物含量折算成甲烷应2mg*kg~l。

（3）对照标准样品。即确知数量的脂肪酸甲酯组分的混合样或已知脂肪酸甲酯组分的油样品。这类标准样品的组成最好与待测样品的组分相似。

操作条件

选择最佳气相色谱操作条件必须考虑以下几个因素色谱柱的柱长及其内径大小、柱温、载气流速、峰间分辨率、样品量、分析时间、检测器和静电计对样品量的大小必须具有相应的线性特性。在一般情况下，要求硬脂酸甲酯在15min内洗脱出来，色谱柱的理论塔板数大于或等于。

如果仪器性能允许，气化室温度应维持约℃，检测器温度应高于柱温。氢气流入检测器的速度应为载气流速的一半。当氮气作载气时，色谱的内径为2mm时，氢气的流速可相等于载气的流速。氧气的流速约为氢气流速的5～10倍。

色谱柱的性能指标

配制混有同量的硬脂酸甲酯和油酸甲酯的测试样品，或用黄油的脂肪酸甲酯组成为测试样品。调节进样量、柱温和载气流速，使硬脂酸甲酯在溶剂峰后约15min内洗提出来。其峰高应约为记录纸满刻度的3/4。分别在硬脂酸和油酸两蜂的拐点作切线与基线相交，由各自的交点处量出其相应的峰底宽W；和W∶（mm），又量出溶剂峰与硬脂酸峰顶间的距离（S），以及硬脂酸和油酸两峰顶间的距离Y（mm）。由此可计算出有效理论塔板数n和分辨率R。其计算公式如下∶

选择的气相色谱操作条件必须保证色谱柱的理论塔板数大于或等于。硬脂酸甲酯和油酸甲酯两峰的分辨率大于或等于1.25。另外还要求亚麻酸甲酯（18∶3）与花生酸甲酯（20∶0），及花生——烯酸甲酯（20∶1）分开。由于使用一定期限后，分辨率会渐渐变小。当其小于或等于1.25时，必须更换色谱柱。

测定

当仪器的基线稳定后，注入5%～10%脂肪酸甲酯的庚烷溶液0.1～2μL。如果要求测定痕迹脂肪酸组成，则可将样品浓度增至10倍。注入样品时针头一旦穿过注射口的硅橡胶隔板就应迅速注入样品，并立即拔出针头，在记录纸上作出标记。还必须注意由于溶剂中杂质或针头的空气都会出现小峰。如果必须保证峰在记录纸上标记出来就需要调节衰减档。为了使样品中大多数组分不被衰减掉尽可能的取小的衰减档。

为了测定低于12碳数的脂肪酸组成，采用较低的柱温是合适的。如果测定高于20碳数的脂肪酸组成，适宜于采用高柱温或采用程序升温的方法。如测定低于12碳数脂肪酸甲酯时，在柱温℃时注入，然后按每分钟升高4～8℃的加热速率升至最适宜温度或程序升温至某固定点，继续维持这温度至一定的时间，使所有的组成被洗脱出来。如果仪器无程序升温装置，可调节在℃和℃两个固定温度点进行测定。

结果计算

（1）归一化法。在使用归一化法作为定量计算法时，即色谱图上所有的组分的峰面积之和为%。如果仪器带有积分仪装置，就可使用其显示的数值。如果没有的话可使用三角形面积计算法，在每一峰的两边作切线与基线相交，量出半峰宽并乘以峰高，再乘以衰减倍数。对于自动衰减峰，其峰为满图纸跨度。在这种情况下，必须在峰高的2/3处在峰的外边作切线与底边相交，峰面积即以峰高（按衰减倍数加以校正）乘以1/2峰底宽。

如果样品中含有小于12个碳原子数的组成含量并不明显存在，则可用质量百分数的计算方法计算，计算单个脂肪酸甲酯百分含量，表达式如下∶

（2）内标法。当只要测定试样中某几个组分，而且试样中所有组分不能全部出峰时，可采用此法。

所谓内标法是将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量及其在色谱图上相应的峰面积比，求出某组分的含量。例如要测定试样中的组分∶（质量为mi）的百分含量Ci%，可于试样中加入质量为mi.的内标物，试样质量为mi，则

转载请注明：http://www.abuoumao.com/hykh/3675.html