谷胱甘肽过氧化物酶GSHPx检测试

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(微板法)

产品货号：BA

产品规格：T

产品简介：

谷胱甘肽过氧化物酶(GlutathionePeroxidase，GSH-Px)是一种含硒的水溶性四聚体蛋白酶。几平在所有组织中都有分布，在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显的变化，该酶可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶不仅具有消除自由基和衍生物的作用，还与过氧化氢酶(CAT)、磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PH-GSH-Px)、谷胱甘肽S转移酶(GST)构成不同基质特异性的多水平的还原有机氢过氧化物系统，减少脂质过氧化物的形成，增强机体抗氧化损伤能力。

谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(GlutathionePeroxidaseAssayKit)是一种以过氧化氢为底物，通过微板法检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有栖少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，该检测法的缺点谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇，在特殊情况下会影响检测准确性。硒是GSH-Px的必须组成部分，每分子该酶含有含有四分子硒，该酶的活性中心是硒半胱氨酸，测定该酶的活力可以衡量有机体硒水平。其检测原理是：GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)与苯甲酸显色液发生氧化反应，使之生成黄色阴离子，通过酶标仪检测nm处吸光度值测定该阴离子的浓度，间接推算GSH减少的量。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料：

1.生理盐水或PBS

2.离心管、1.5mlEP管或96孔板

3.酶标仪

4.水浴锅或恒温箱

5.离心机

操作步骤(仅供参考):

1.样本处理:

a.血清、血浆样本：从待测样本中分离出的血清或血浆不应有溶血，如果含有，应去除红细胞后检测，如超过检测范围，用生理盐水稀释后检测。血清去除红细胞的简易方法如下:

用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少ul全血，4℃g离心5min。弃上清，用预冷的10倍体积的样品匀浆液重悬红细胞沉淀，再同前离心，弃上清。加入约4倍体积预冷的ddH2O裂解红细胞沉淀，r/min离心5min，取上清；亦可采用ACK红细胞裂解液等去除红细胞，取上清。

b.组织样本：动物用含有20U/mlheparin的生理盐水(0.9%NaClcontaining20U/mlheparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照每20mg组织加入ul样品匀浆液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。4℃，g离心10min。取上清用于酶活性的测定。

c.细胞样本：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用细胞刮或EDTA处理细胞收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤1次。按照每细胞加入-ul匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃g离心10min，取上清用于酶活性的测定。亦可采用Western及IP细胞裂解液参考相应说明裂解细胞样品，按照每细胞加入-u1裂解液的比例进行裂解，取上清用于酶活性的测定。

d.植物样本：称取0.2g新鲜样品或-80℃冻存的样品，放入预冷的研钵中，加入2ml预冷的磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0），在冰浴上研磨或匀浆，转入离心管，4℃r/min离心10~15min，取上清，用于酶活性的测定。

2.GSH工作液的配制：取0.5mlddH20加入15.4mgGSH中，充分溶解开混匀，即获得GSH储存液(mmol/L)，立即分装后-20℃保存。取适量的GSH储存液(mmol/L)，按GSH配制液：GSH储存液(mmol/L)=99:1的比例稀释至1mmol/L，即为GSH工作液(1mmol/L)，该溶液配制好以后可4℃保存1天。

3.氧化工作液的配制：准确取氧化剂0.1ml加入6.5mlddH20，即为氧化储存液(×)，4℃保存。临用前，准确取氧化储存液(×)0.1ml加入6.5mlddH2O，即为氧化储存液(×)，4℃保存，临用前准确取氧化储存液(×)0.1ml加入9.9mlddH2O，即为氧化工作液；4℃保存，1天有效。

4.GSH-Px酶促反应：可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：

5.GSH-Px显色反应：可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：

6.GSH-Px测定：混匀，置于室温孵育1min，以ddH2O调零，用酶标仪检测nm处吸光度(即为A空白、A本底、A测定）；如果用酶标仪96孔板每孔应加μl；如果用分光光度计，比色杯光径应为1cm，加入的量应根据比色杯的最小量程而定；经测定，一般情况下A空白在0.~0.05之间，A本底在0.1~0.3左右。

计算:

谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义：排除非酶促反应，在37℃，每1L血清，1min内可以催化1μmolGSH氧化所需(减少)的酶量为一个GSH-Px活性单位。

GSH-Px(U/L)=(A本底-A测定)/(A本底-A空白)×

式中：A空白=空白对照的吸光度

A本底=本底对照的吸光度

A测定=待测样品的吸光度

=0(ml)/5(min)

注：a、[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力的单位为U/L=mU/ml。

b、样品(如组织样本)中谷胱甘肽过氧化物酶活力=[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]×稀释倍数/样品中的蛋白浓度]

[样品中(如组织样本)谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为:U/mg或mU/mg蛋白样品中的蛋白浓度1的单位为:mg/ml。

c、计算示例：样品的蛋白浓度经测定为05mg/ml，稀释2倍后进行测定。一般情况下，A空白在0.~0.05之间，A本底在0.10~0.3左右。如果A本底＝0.30，A测定＝0.20，A空白＝0.那么:

液体样本GSP-Px活力=(0.30-0.2)/(0.30-0.)××2=.7U/L

组织样本GSP-Px活力=.7U/L×2/(0.5mg/ml)=.8mU/mg(蛋白)

参考区间：成年人血清GSP-Px：~U/L

注意事项：

1.上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。

2.本法中所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定，如果在样品中的还原剂无法避免，例如DTT、巯基乙醇等，则这些还原剂的总浓度至少低于0.1mM；0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。

3.常用的TritonX-、Tween20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，会影响本试剂盒的测定，如果必须使用这些去垢剂，最好使用纯度较高并注明含较低浓度过氧化物的去垢剂。

4.样品取出后最好立即测定，也可以-80℃冻存待以后测定。

5.一定要严格控制反应时的温度，否则会引起较多误差。

有效期：12个月有效。

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