用于牙科应用的人工唾液溶液中的CoCrW

上海商虎合金集团

为了评估其作为假牙材料的应用，在人工唾液和0.15mol.L-1NaCl介质中对CoCrW合金进行了体外细胞毒性测试、表面表征和电化学研究。使用的技术有：阳极极化曲线、计时电流测量、电化学阻抗谱(EIS)、扫描电子显微镜(SEM)、能量色散X射线光谱(EDS)分析和X射线光电子能谱(XPS)。还进行了细胞毒性试验。比较CoCrW合金在两种研究介质中的电化学行为，从腐蚀电位(Ecorr)到mV阳极过电压。从电化学测量中观察到，两种介质中的CoCrW合金仅呈现普遍腐蚀。SEM和EDS分析表明，该合金存在碳化铌和硅锰氧化物作为非金属夹杂物。XPS结果表明钴对钝化膜的形成没有显着贡献。细胞毒性试验表明CoCrW合金没有细胞毒性。这些结果表明CoCrW合金可用作生物材料，用作牙种植体中的假体。

介绍

由于其机械性能，金属合金自20世纪初就被用作牙科材料(1,2)。如今，由于经济问题，非贵重合金在牙科领域正在取代贵重合金。牙科用非贵金属合金表面有一层薄的钝化氧化物膜。这种钝化膜必须具有高附着力、致密性、高电阻和无裂纹等缺陷(1,2)。

口腔环境非常适合促进金属材料的氧化。唾液的数量和质量、唾液pH值、牙菌斑、蛋白质含量、食物和液体摄入的化学和物理特性以及一般口腔健康状况等因素可能会影响口腔中的金属腐蚀(3)。口腔环境中的牙科材料有两个问题：腐蚀产物释放到身体引起的局部效应或全身性损伤以及对合金物理性能和临床性能的影响（4-7）。

CoCr基合金已用于假牙，因为它们具有良好的耐腐蚀性(8,9)。最近，已经开发出钨含量高的合金而不是钼，旨在提高陶瓷-金属的附着力(10)。另一方面，与CoCrW合金(13,14)相比，CoCrMo合金得到了更多的研究(4-12)。

在这项工作中，在人工唾液和0.15mol.L-1NaCl介质中对CoCrW合金进行了体外细胞毒性测试、表面表征和电化学行为，以评估其作为假牙材料的应用。为了表征合金表面，使用极化曲线、计时电流法、电化学阻抗谱（EIS）、扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDS）和X射线光电子能谱。还进行了体外细胞毒性试验，以研究拟议合金作为植入材料的生物相容性。

材料与方法

样品和解决方案

CoCrW合金的化学成分见表1。

人工唾液的成分由三种不同的溶液制备。使用以下试剂/浓度(mol.L-1)：溶液A：

表1CoCrW合金的化学成分(wt)

NaH2PO4/0.+KCl/1.+NaCl/0.+NH4Cl/0.

+柠檬酸钠/3.74x10-3+乳酸/0.；溶液B-尿素/0.+尿酸/4.46x10-3+NaOH/5x10-3和溶液C：KSCN/0.。通过混合A、B和C溶液(1:1:1)每天制备唾液溶液，然后在高纯度去离子水(15)中稀释50倍。

所有实验均使用自然曝气溶液在(37.0±0.5)°C和6.6pH值（口腔条件）下进行三次重复。

电极

CoCrW合金工作电极是由棒的中心部分制成的圆盘，面积为0.90cm2。圆柱形环氧树脂底座与钢盘配合。一根同心黄铜棒连接到钢+环氧树脂基体上。通过依次用更细等级的、、和目砂纸抛光制备电极，然后在实验前用蒸馏水和乙醇彻底冲洗并风干。

辅助电极由铂箔组成，每次实验前都用酸清洗并燃烧。饱和甘汞电极（SCE）用作参比电极。

电化学实验

通过动电位极化阳极曲线和计时电流曲线评估耐腐蚀性。所研究的CoCrW合金在人工唾液和0.15mol.L-1NaCl溶液中。这些评估是在每个电位应用达到恒定电流后进行的，从阳极方向上的开路电位开始，从Ecorr到0.9Vvs.SCE，使用1mV.s-1扫描速率。作为工作标准，假设当电流密度为10mA/cm2时达到跨钝化电位。电化学阻抗谱(EIS)测量在8个十倍频（从KHz到10mHz）进行。潜力是

±8mV,p.p.实验在37°C下进行。一种

μAutolabtypeIII/FRA2恒电位仪（MetrohmAutolabBV，荷兰）用于与频率响应检测器和微型计算机耦合。

表2.使用能量色散光谱(EDS)分析CoCrW的不同表面区域抛光后的合金

表面表征

扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线光谱(EDS)分析

SEM和EDS分析在与StereoscanLeica扫描电子显微镜（LeicaMicrosystems）耦合的WDX牛津显微镜（LeicaMicrosystems.Wetzlar，德国）上进行。样品使用1μm金刚石膏抛光，用水和乙醇冲洗并风干。使用EDS分析了不同的表面区域（表2）。

X射线光电子能谱(XPS)分析

XPS分析在光谱仪（型号XSAMHS；KratosAnalyticalLtd,Manchester,UK）上在超高真空（约10-8Torr）下进行。非单色MgKα(hν=.6eV)辐射用作X射线源，在12kV电压下具有5mA发射电流。将样品抛光，用去离子水冲洗，在超声波浴中用分析级丙酮清洗5分钟，然后用去离子水冲洗。在这些实验之前，将样品在Ecorr浸入人造唾液和0.15mol.L-1NaCl溶液中8小时。8小时后，分析表面成分以研究钝化膜成分中钴(Co)和铬(Cr)的存在。作为结合能参考值，对应于外来烃(16)的碳峰的值是.8eV。评估包括用于背景扣除的Shirley程序、混合高斯/洛伦兹函数和用于拟合峰值的最小二乘程序。

表面表征

扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线光谱(EDS)分析

SEM和EDS分析在与StereoscanLeica扫描电子显微镜（LeicaMicrosystems）耦合的WDX牛津显微镜（LeicaMicrosystems.Wetzlar，德国）上进行。样品使用1μm金刚石膏抛光，用水和乙醇冲洗并风干。使用EDS分析了不同的表面区域（表2）。

X射线光电子能谱(XPS)分析

XPS分析在光谱仪（型号XSAMHS；KratosAnalyticalLtd,Manchester,UK）上在超高真空（约10-8Torr）下进行。非单色MgKα(hν=.6eV)辐射用作X射线源，在12kV电压下具有5mA发射电流。将样品抛光，用去离子水冲洗，在超声波浴中用分析级丙酮清洗5分钟，然后用去离子水冲洗。在这些实验之前，将样品在Ecorr浸入人造唾液和0.15mol.L-1NaCl溶液中8小时。8小时后，分析表面成分以研究钝化膜成分中钴(Co)和铬(Cr)的存在。作为结合能参考值，对应于外来烃(16)的碳峰的值是.8eV。评估包括用于背景扣除的Shirley程序、混合高斯/洛伦兹函数和用于拟合峰值的最小二乘程序。

细胞毒性试验

通过在与合金样品接触后将细胞培养物暴露于溶液中进行细胞毒性测定，在37°C的培养基MEM中浸泡10天。NCTC克隆细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)库。根据国际标准化组织(ISO)(19)，在之前的论文(17,18)中描述了中性红吸收(NRU)方法，评估了细胞毒性效应。

结果

电化学结果

人工唾液和0.15mol.L-1NaCl溶液的腐蚀电位（固定开路电位值）为

-±28mVSCE和-±23

mVSCE分别（图1A）。阳极动电位极化曲线由腐蚀电位获得并绘制，以评估电位的影响，以确定合金钝化的电位范围和跨钝化电位的值。进行计时电流测试是为了验证钝化膜上是否存在点蚀。从极化曲线获得的结果绘制在图1A中，其中合金的计时电流曲线在不同的电位值（图1B和1C），分别在人工唾液和NaCl介质中。计时电流结果显示在不同的电位下，并证实了通过动电位极化阳极曲线获得的结果，表明金属表面钝化的电位范围。在不同电位值下观察到的电流密度恒定值表明合金不存在点腐蚀。

EIS被用来研究钝化膜/电解质界面和随电位增加的演变。图2显示了CoCrW在人工唾液（图2A）和0.15mol.L-1NaCl溶液（图2B）中Ecorr和0.25VSCE的Bode（模量和相）图。对于两种介质中的合金/溶液界面，可以看到类似的行为：阻抗的虚部和实部随着电位变得比Ecorr更正而减少。建议的等效电路如图2C所示，

其中R对应于电解质电阻，CPE和Rf分别对应于恒相元件（伪电容）和通过保护膜氧化反应的极化电阻。CPEdc和Rct分别对应于双层恒相CoCrW合金氧化的元素和电荷转移电阻。在两种媒体中为Ecorr和0.25VSCE提出了相同的电路。

表面表征

进行SEM和EDS分析以评估非金属夹杂物的存在。抛光后使用EDS分析不同的表面区域

1mm钻石膏。图3显示了三个不同的区域，1、2和3。根据EDS分析，区域1表示整体成分，区域2对应于碳化铌，区域3是由于存在硅和锰氧化物。

XPS用于研究钝化膜成分中Cr和Co的存在。表3显示了钝化膜中元件的绝对电位。表面的铬含量在两种介质中都高于钴，与唾液相比，在0.15mol.L-1NaCl中更高。结果表明钝化膜中存在铬(III)和钴氧化物。

细胞毒性试验

进行细胞毒性试验，结果见图4；细胞毒性评价采用中性红吸收法。阳性和阴性对照用于确认测试程序的适当性能和/或评估CoCrW合金的结果，以及控制电池灵敏度、提取效率和其他测试参数。细胞活力高于IC50()线的样品被认为是无毒的，低于IC50()线的样品是有毒的。

讨论

图1A显示盐水溶液中的Ecorr更正，表明与人工唾液介质相比，形成更好的被动膜。CoCrW合金（图1A）在大的分析电位范围内显示出较小的电流密度值（1至10A/cm2），表明在两种介质中形成的钝化膜具有良好的特性。CoCrW合金在NaCl介质中表现出较低的钝化电流密度，表明氯化钠的钝化膜比人工唾液中的钝化膜更多。计时电流曲线（图1B和1C）即使在高电位下也显示出恒定的电流密度值，表明没有点腐蚀。结果表明，CoCrW合金在0.9V和两种介质中的高电流密度值下仅呈现普遍腐蚀。

通过EIS在Ecorr和0.25VSCE下研究了钝化膜的特性。结果示于图2A和2B中。波特相图是典型的无源系统，在低频时阻抗的实部和虚部均具有高值。在波特图中

Z

的值约为Ω/cm且角度大于75，显示形成的薄膜具有高阻容特性。波特相图指出了人工唾液和氯化钠的相同机制。图2C还显示了根据模拟等效电路对实验结果的拟合。在整个研究频率范围内观察到实验结果和所提出的等效电路之间的良好一致性，表明两种介质中的定性机制相同。在氯化钠介质中形成的膜（图2B）比在人工唾液中形成的膜（图2A）具有更好的质量。

钝化膜的成分由Ecorr的XPS分析。氯化钠中形成的钝化膜中铬和钴的含量比人工唾液中的多。保护膜由两种介质（20）中的氧化铬形成。Hodgson等人也获得了这些结果。(21)。在CoCr基合金中，只有在高电位时才会发现铬氧化的另一种状态，如Cr(VI)(21,22)。Co2+和Co3+之间的化学位移非常小(22-24)，表明难以表征金属表面的氧化态。薄膜中的少量钴表明它扩散到溶液中并且没有显着贡献到氧化物相。

在这项研究中，测试合金即使在提取物浓度下也没有出现毒性作用。所有活力曲线均高于细胞毒性指数线，这意味着CoCrW合金在该测定中没有显示出细胞毒性效应。在这项研究中，CoCrW合金表现出良好的行为，形成了富含铬(III)氧化物和少量钴氧化物的均匀钝化膜。在0.15mol.L-1NaCl中形成的薄膜比在人工唾液中形成的薄膜更具电容性和电阻性。人工唾液的化学复杂性可能导致钝化膜的更大不稳定性。SEM和EDS表明CoCrW合金呈现碳化铌和硅和锰的氧化物作为非金属夹杂物。细胞毒性试验验证了非细胞毒性

根据所使用的方法对合金的影响。

这项研究的结果表明，从电化学和细胞毒性的角度来看，CoCrW合金可用作生物材料，用于种植牙假体。

图1所示。CocrW合金在唾液中的电位、极化曲线。在每一个潜在的应用中，7rB和C的摩尔氯化物显示了时间的变化。

细胞毒性试验

通过在与合金样品接触后将细胞培养物暴露于溶液中进行细胞毒性测定，在37°C的培养基MEM中浸泡10天。NCTC克隆细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)库。根据国际标准化组织(ISO)(19)，在之前的论文(17,18)中描述了中性红吸收(NRU)方法，评估了细胞毒性效应。

结果

电化学结果

人工唾液和0.15mol.L-1NaCl溶液的腐蚀电位（固定开路电位值）为

-±28mVSCE和-±23

mVSCE分别（图1A）。阳极动电位极化曲线由腐蚀电位获得并绘制，以评估电位的影响，以确定合金钝化的电位范围和跨钝化电位的值。进行计时电流测试是为了验证钝化膜上是否存在点蚀。从极化曲线获得的结果绘制在图1A中，其中合金的计时电流曲线在不同的电位值（图1B和1C），分别在人工唾液和NaCl介质中。计时电流结果显示在不同的电位下，并证实了通过动电位极化阳极曲线获得的结果，表明金属表面钝化的电位范围。在不同电位值下观察到的电流密度恒定值表明合金不存在点腐蚀。

EIS被用来研究钝化膜/电解质界面和随电位增加的演变。图2显示了CoCrW在人工唾液（图2A）和0.15mol.L-1NaCl溶液（图2B）中Ecorr和0.25VSCE的Bode（模量和相）图。对于两种介质中的合金/溶液界面，可以看到类似的行为：阻抗的虚部和实部随着电位变得比Ecorr更正而减少。建议的等效电路如图2C所示，

图2。()CoCrW合金在氯化钠(A)和人工唾液下的阻抗空间。等效电路用于拟合不同电势下的实验数据。

其中R对应于电解质电阻，CPE和Rf分别对应于恒相元件（伪电容）和通过保护膜氧化反应的极化电阻。CPEdc和Rct分别对应于双层恒相CoCrW合金氧化的元素和电荷转移电阻。在两种媒体中为Ecorr和0.25VSCE提出了相同的电路。

表面表征

进行SEM和EDS分析以评估非金属夹杂物的存在。抛光后使用EDS分析不同的表面区域

1mm钻石膏。图3显示了三个不同的区域，1、2和3。根据EDS分析，区域1表示整体成分，区域2对应于碳化铌，区域3是由于存在硅和锰氧化物。

XPS用于研究钝化膜成分中Cr和Co的存在。表3显示了钝化膜中元件的绝对电位。表面的铬含量在两种介质中都高于钴，与唾液相比，在0.15mol.L-1NaCl中更高。结果表明钝化膜中存在铬(III)和钴氧化物。

表3浸渍后CoCrW合金的X射线光电子能谱(XPS)结果

图3.通过1毫米金刚石膏抛光的CoCrW合金样品的SEM和EDS图像。

细胞毒性试验

进行细胞毒性试验，结果见图4；细胞毒性评价采用中性红吸收法。阳性和阴性对照用于确认测试程序的适当性能和/或评估CoCrW合金的结果，以及控制电池灵敏度、提取效率和其他测试参数。细胞活力高于IC50()线的样品被认为是无毒的，低于IC50()线的样品是有毒的。

讨论

图1A显示盐水溶液中的Ecorr更正，表明与人工唾液介质相比，形成更好的被动膜。CoCrW合金（图1A）在大的分析电位范围内显示出较小的电流密度值（1至10A/cm2），表明在两种介质中形成的钝化膜具有良好的特性。CoCrW合金在NaCl介质中表现出较低的钝化电流密度，表明氯化钠的钝化膜比人工唾液中的钝化膜更多。计时电流曲线（图1B和1C）即使在高电位下也显示出恒定的电流密度值，表明没有点腐蚀。结果表明，CoCrW合金在0.9V和两种介质中的高电流密度值下仅呈现普遍腐蚀。

通过EIS在Ecorr和0.25VSCE下研究了钝化膜的特性。结果示于图2A和2B中。波特相图是典型的无源系统，在低频时阻抗的实部和虚部均具有高值。在波特图中

Z

的值约为Ω/cm且角度大于75，显示形成的薄膜具有高阻容特性。波特相图指出了人工唾液和氯化钠的相同机制。图2C还显示了根据模拟等效电路对实验结果的拟合。在整个研究频率范围内观察到实验结果和所提出的等效电路之间的良好一致性，表明两种介质中的定性机制相同。在氯化钠介质中形成的膜（图2B）比在人工唾液中形成的膜（图2A）具有更好的质量。

图4.CoCrW合金在中性红吸收方法的细胞毒性测定中的活力曲线。

钝化膜的成分由Ecorr的XPS分析。氯化钠中形成的钝化膜中铬和钴的含量比人工唾液中的多。保护膜由两种介质（20）中的氧化铬形成。Hodgson等人也获得了这些结果。(21)。在CoCr基合金中，只有在高电位时才会发现铬氧化的另一种状态，如Cr(VI)(21,22)。Co2+和Co3+之间的化学位移非常小(22-24)，表明难以表征金属表面的氧化态。薄膜中的少量钴表明它扩散到溶液中并且没有显着贡献到氧化物相。

在这项研究中，测试合金即使在提取物浓度下也没有出现毒性作用。所有活力曲线均高于细胞毒性指数线，这意味着CoCrW合金在该测定中没有显示出细胞毒性效应。在这项研究中，CoCrW合金表现出良好的行为，形成了富含铬(III)氧化物和少量钴氧化物的均匀钝化膜。在0.15mol.L-1NaCl中形成的薄膜比在人工唾液中形成的薄膜更具电容性和电阻性。人工唾液的化学复杂性可能导致钝化膜的更大不稳定性。SEM和EDS表明CoCrW合金呈现碳化铌和硅和锰的氧化物作为非金属夹杂物。细胞毒性试验验证了非细胞毒性

根据所使用的方法对合金的影响。

这项研究的结果表明，从电化学和细胞毒性的角度来看，CoCrW合金可用作生物材料，用于种植牙假体。

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