海洋胶原的常规检测方法下

海洋胶原的常规检测方法（下）

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导读

介绍了海洋胶原理化和微生物检测方法，这一篇主要介绍了胶原生物相容性研究及检测方法，以期为海洋胶原在生物医学领域应用提供参考和证据支持。

注：胶原浸提液根据GB/T标准要求来制备

生物相容性研究及检测方法

一、细胞毒性实验

从液氮罐中取出L-小鼠成纤维细胞冻存管，置于37℃温水中迅速解冻，移入10ml离心管中加入5ml胎牛血清高糖培养基混合、离心，弃去上清，再加入5ml胎牛血清高糖培养基混悬接种于培养瓶中。37℃，5%CO2饱和湿度培养次日换液。

取生长至80％培养瓶底面积的L-小鼠成纤维细胞，0.25%胰酶消化，计数后调整细胞浓度，用胎牛血清高糖培养基制成细胞密度为2*个／ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，接种量为ul／孔。再将胶原浸提液以50ul／孔接入，每个浓度做８个孔，以PBS为阴性对照，37℃，5%CO2饱和湿度培养。细胞在96孔板上培养12ｈ后吸弃上清，PBS清洗一遍，每孔加入新鲜培养液和20ulMTT溶液，孵育４ｈ后吸去培养液并加入ulDMSO，震荡10min，选择nm为检测波长，nm为参考波长，在酶标仪上测定每孔的光吸收值,计算细胞相对增值

二、急性全身毒性实验

昆明小鼠，体重18-20g，雌雄各半，将动物分为实验组和对照组，每组10只雄鼠和10只雌鼠。每只小鼠按照剂量50ml/kg注射，处理组给予胶原生理盐水浸提液及2倍生理盐水浸提液，对照组给予等量的生理盐水。注射24h、48h、72h后观察各组小鼠的一般状态、毒性表现及死亡动物数。根据体重变化、中毒症状或有无死亡等来确定胶原毒性。在72h将小鼠处死解刨，观察各脏器有无病变，称量器官（心、肝、脾、肺、肾）重量，计算脏器指数。

三、皮内刺激实验

新西兰大白兔，雄性，体重不低于2kg，分为4组，分别为胶原组（注射胶原浸提液）、对照组（注射0.9%生理盐水）和阳性对照组（注射20%乙醇）。实验前单只称重，彻底除去白兔背部脊柱两侧被毛，以75%乙醇消毒实验部位，每侧取5隔点作为注射点，注射所需剂量后分别于0h、24h、48h、72h各时间点观察并记录各注射点的红斑和水肿情况，对照皮内反应红斑计分系统进行计分。

在注射前和注射后24h、48h、72h分别于兔耳缘静脉取血，采用兔白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫分析试剂盒、兔白细胞介素-4（IL-4）酶联免疫分析试剂盒进行检测，利用高敏度竞争性ELISA的替代工具双抗原夹心法测定新西兰大白兔血浆中的白细胞介素-4和-6水平。记录nm波长下各组实验兔血浆的吸光度值，以标准曲线的推算的共识计算各组分血浆中的IL-4和IL-6的滴度。

四、植入实验

新西兰大白兔，雄性，体重不低于2kg。兔耳静脉注射3%巴比妥钠进行麻醉，在脊柱两侧等距离各选2个植入部位，一侧植入胶原样品，另一侧植入对照胶原样品。材料植入后，用头孢松钠对实验兔进行抗感染注射，每天2次，连续注射3天。

分别于植入后1周、4周和8周处死实验动物，沿脊柱方向剖开皮肤组织，观察植入点及周围组织有无病变或其他组织反应情况。分离皮下组织，切取植入材料和周围其他组织，根据GB/T标准要求的操作方法制备样品试液。

采用兔白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫分析试剂盒、兔白细胞介素-4（IL-4）酶联免疫分析试剂盒进行检测，利用高敏度竞争性ELISA的替代工具双抗原夹心法测定新西兰大白兔血浆中的白细胞介素-4和-6水平。记录nm波长下各组实验兔血浆的吸光度值，以标准曲线的推知的公式计算样品试液中炎性因子的滴度。

五、热原实验

新西兰大白兔，雄性，体重不低于2kg，分为3组，每组2只，分别为胶原浸提液处理组和生理盐水处理组。热源检查注射前，使用兔专用固定器将6只新西兰大白兔固定，将蘸取甘油的温度计插入兔肛门中，等待15min，记录温度。注射前测温后，每组动物静脉注射量以2ml/kg计。注射后每隔30分钟测一次肛温，共测6次，每次15min。将实验的6次体温中数值最高的一次与注射前温度相减即为实验兔体温升高温度。

六、溶血实验

新西兰大白兔，雄性，体重不低于2kg，采血20mL，加20％草酸钾1mL制成抗凝兔血。取8mL抗凝兔血加生理盐水10mL稀释。取试验材料胶原的浸提液及蒸馏水(阳性对照)、生理盐水(阴性对照)各10mL于试管内，重复3份。放入60℃水浴中，预热60min。每个试管再加入0．2mL稀释抗凝兔血，于37℃水浴60min，g离心10min，取上清液。用分光光度计在nm波长测上清液的吸光度值(A)，取平均值。计算各材料的溶血率，计算公式：溶血率(％)=(材料组吸光度一阳性对照组吸光度)／(阴性对照组吸光度一阳性对照组吸光度)。

七、过敏实验

实验豚鼠，体重-g，分为三组，每组8只。样品组注射胶原浸提液；对照组注射灭菌的0.9%生理盐水；阳性对照组注射1.2mg/ml牛血清白蛋白。对各实验组豚鼠称重并记录体重后，隔天每只每次腹腔注射0.5ml液体，共注射三次进行致敏。每天观察并记录各组实验动物的行为和体征。将所有组别分为A\B两个小组，每小组各四只动物。在首次注射后的第14天，对A组别的豚鼠进行激发，即豚鼠足背静脉注射各组液体1ml，诱发过敏反应。观察激发后30min内豚鼠有无过敏反应症状。在首次注射后第21天，对B组进行激发，同样观察豚鼠有无过敏反应症状。

在注射前对全部豚鼠，第14天对A组豚鼠和第21天对B组豚鼠眼眶取血，提取豚鼠血浆后进行酶联免疫吸附测定（组胺、肥大细胞蛋白酶、IgE和IgG含量），在nm处测定血浆的吸光度值，计算各组中过敏反应相关因子的浓度。

在21天分别处死各组豚鼠，解剖后观察并记录各器官形态有无异常，取出肺部组织进行组织切片分析。

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