细胞工程复习资料

一、细胞工程概述

1.生物工程：也称生物工艺学，一般称之为生物技术。是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品或创造新物种的一门综合技术。

2.细胞工程（Cellengineering）：是指主要以细胞为研究对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的的利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织、产品或新型物种的一门综合性科学技术。

3.广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。

4.狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。

5.干细胞（stemcell）：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

6.细胞工程的研究内容（研究生物类型，实验操作对象）

(1)根据研究生物类型不同，细胞工程可分为动物细胞工程、植物细胞工程、微生物细胞工程。

①　动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。

②　植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。

(2)根据实验操作对象不同，细胞工程可分为细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体操作、转基因生物等

7.组织工程（tissueengineering）：是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。

8.动物细胞与组织培养：从体内取出组织，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。习惯上又泛指所有体外培养，即：器官培养，组织培养，细胞培养。

9.植物细胞与组织培养：在无菌条件下，利用人工培养基对植物组织及细胞的培养，一般包括原生质体培养、细胞培养和植物组织培养等培养技术。是植物细胞工程的最基本技术。

10.细胞融合：又称为细胞杂交，是指用自然或人工方法，使两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。

融合分类：

化学法：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合。

物理法：电融合

生物法：仙台病毒法

11.单克隆抗体（McAb）：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子就是单克隆抗体。

12.细胞重组：又叫细胞拆合，是指从活细胞中分离出细胞器及其组份，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生活生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。

13.克隆（clone）：是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体，也指通过克隆方式生产克隆群体的过程或手段。

14.动物生物反应器：一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器。几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器，从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得。例如，乳腺、膀胱、血液等。

15.酶促褐变（enzymebrowning）：是在有氧的条件下，酚酶催化分类物质形成醌及其聚合物的反应过程。

16.细胞工程的重要应用（植物、动物）

(1)植物细胞工程的应用

①　优质植物脱毒和快速繁殖

②　细胞工程育种：利用培养变异，筛选优良突变体

③　利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性

④　利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性

⑤　倍性育种

⑥　离体种质保存

⑦　珍稀植物资源的保存与保护

⑧　利用植物细胞培养生产此生代谢物

(2)动物细胞工程的应用

①　动物细胞培养生产医药产品（单克隆抗体）

②　新品种培育

③　试管动物与婴儿

④　组织工程

⑤　珍稀动物资源的保存与保护

⑥　利用动物细胞培养生产次生代谢物

二、细胞全能性与形态发生

1.植物组织培养：从有机体内取出植物的组织或细胞，在无菌条件下模拟有机体内生理条件，在体外进行培养，并使之生存或长成新的完整植株的一种实验技术。

2.植物细胞培养：指植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不在形成组织。主要以生产次生代谢物为目的的大规模细胞培养技术。

3.植物组织与器官培养：是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织等在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽或者长成新的完整植株的一种实验技术。

4.细胞全能性（totipotency）：简单地讲，一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性。

5.植物细胞全能性：指植物体的每个细胞携带着一个完整基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。

6.全能细胞：是指能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育成一个完全相同的生物体。

7.愈伤组织（callus）：是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的、无组织结构的疏散排列的薄壁细胞。

8.外植体（explant）：由活体植物上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等，是植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料。

9.植物连续的器官分化是由顶端分生组织细胞发育完成的。

茎尖、根尖及形成层细胞

周期中细胞

这类细胞始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期

筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞

植物细胞终端分化细胞

为永久失去分裂能力的细胞

表皮细胞及各种薄壁细胞

G0细胞

在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂

10.植物细胞或组织的离体培养技术就是细胞脱分化与再分化的控制过程。（细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程。）

11.脱分化（dedifferentiation）：是一个已分化的细胞恢复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。

12.细胞分化（differentiation）：指导致细胞形成不同结构，并引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

形成愈伤组织

13.脱分化后

形成胚性组织→体细胞胚

14.在离体培养条件下，植物细胞经过再分化形成完整个体可以通过两种途径：一是器官发生，二是体细胞胚胎发生。

15.器官发生途径：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

经过愈伤组织：愈伤组织→生长中心形成→器官原基及器官形成

16.器官发生过程

茎尖培养中芽的形成

不经过愈伤组织

外植体直接发生芽

17.体细胞胚胎发生途径：植物离体培养下没有经过受精过程，但经历了类似于胚胎发育过程所形成的胚的类似物，称为体细胞胚或胚状体。

18.直接发生途径：体细胞胚从外植体上直接发生

间接发生途径：由愈伤组织形成

19.在植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的比例低则产生苗，比例高则生根，比例大致相等则产生无结构的愈伤组织。

20.植物组织培养的研究意义：

①　繁殖速度快，经济效益高。

②　占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗。

③　保持植物种性。

④　繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。

21.植物组织培养的基本步骤：

(1)培养材料（外植体）的选择

(2)培养材料（外植体）处理（消毒等）

(3)制备外植体、接种、培养

(4)愈伤组织的诱导、分化

(5)培育苗的炼苗移栽。

22.试管苗玻璃化（vitrification）:是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎段培养物的不定芽。

23.控制和克服玻璃化苗的措施:

针对以上玻璃化苗的产生原因，可采取以下措施来减轻玻璃化现象发生

（1）降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮素等生长抑制物质。

（2）控制适宜的培养温度，避免温度过高，变温培养时注意温差不宜过大。

（3）使用透气性好封口材料，改善培养容器的痛风换气条件，降低容器内湿度。

（4）适当增加培养基琼脂浓度，降低培养基的水势。

（5）减少培养基中含氮化合物的用量，选用低NH4+水平的B5培养基。

（6）增加自然光照，光照强度较弱时，可通过延长时间进行补偿。

（7）控制继代次数。

三、离体培养下的遗传与变异

1.离体培养下的遗传与变异的特点：离体培养中的遗传稳定性；变异的普遍性、局限性、嵌合性。

2.看家基因（housekeepinggene）：是维持细胞最低限度功能所不可少的基因。

3.组织特异性基因/奢侈基因（tissue-specificgene）：这类基因与各类细胞的特殊性有直接的关系，是在各种组织中进行不同的选择性表达的基因。

4.细胞分化能力的强弱称为发育潜能。

5.细胞发育成完整个体的潜能称为细胞的全能性。

6.在发育过程中，细胞的发育潜能逐渐变窄，细胞逐渐失去发育成完整个体的潜能，只能分化出多种组织、细胞的这种发育潜能叫做多能性。

7.去分化：在某些条件下，分化细胞也不稳定，其基因活动模式会发生可逆的变化，又回到未分化状态，这一过程称为去分化。

8.转基因技术基本步骤：（切、接、转、增、检）

(1)目的基因的获得

(2)构建重组DNA

(3)重组DNA分子引入受体细胞

(4)表达目的基因的受体细胞的筛选

9.植物组织：

①　永生组织：植物发育早期，细胞是有分裂能力的，在生长发育过程中，细胞陆续分化失去分裂能力，成为具有特定功能的细胞组织。

②　分生组织

10.真核细胞的体积一般是原核细胞的倍，真核细胞如何解决细胞内重要分子的浓度问题？

答：出现了特化的内膜系统，这样，虽然体积增大了，表面积也大大增加，并使细胞内部结构区室化，一些重要分子的浓度并没有被稀释。

11.由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclons）。而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonalvariation）。

12.离体培养的细胞学基础：细胞分裂（有丝分裂）。

13.体细胞变异的分子遗传学基础：

①　碱基突变

②　DNA序列的选择性扩增与丢失

③　转座子活化

④　DNA甲基化

14.愈伤组织也称无性细胞系，是非严格意义上的克隆。

15.影响离体培养遗传和变异的主要因素：

①　外植体的来源。

②　外源激素。

③　继代培养时间。

④　再生植株的方式。

⑤　外植体细胞中已有变异。

16.植物体细胞变异的应用：

①　改良作物品种，拓宽种质资源。

②　加强外源基因向栽培种的渐渗。

③　遗传学研究：突变体直接用于基因功能的鉴定。

④　发育生物学研究：利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控研究。

⑤　代谢研究。

四、植物脱毒与快速繁殖

1.愈伤组织培养的基本过程：

(1)愈伤组织的形成

①　启动期（或诱导期）：主要是指细胞或原生质体准备分裂的时期，需要采用合适的诱导剂，如IAA、NAA、2，4-D等。

②　分裂期：开始分裂并不断增生子细胞的过程，细胞持续分裂后形成大量细胞团和愈伤组织。

③　分化期：愈伤组织的细胞内部发生一系列形态和生理的变化，分化出形态和功能不同的细胞。

(2)愈伤组织的生长

(3)愈伤组织的分化和形态发生

eg:离体的植物组织、细胞——→愈伤组织——→根芽→植株

①　切开胡萝卜，在中间取一块组织

②　形成层开始形成愈伤组织

③　3-4周后完全形成愈伤组织状态（组织块失去色素）

④　把脱分化后的愈伤组织转移到分化培养基上

⑤　两周后开始长出幼苗

⑥　将幼苗移栽到外部条件下培养（驯化）

2.如何在一个已经受感染的群体中获得无病植株？

①　种子繁殖

②　消除病原菌

3.消除病原菌的方法又是什么？

①　热处理：热水或热空气

②　茎尖处理

③　愈伤组织培养

4.当前脱除植物病毒的方法有：

①　茎尖培养脱毒法

②　热处理脱毒法

③　微体嫁接离体培养脱毒法

④　珠心组织脱毒法

⑤　愈伤组织脱毒法

5.脱除植物病毒的原理及方法

(1)茎尖培养脱毒法：病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点，病毒浓度越稀。因此有可能利用茎尖离体培养脱除植物病毒。

(2)热处理脱毒法：

①　热处理虽然不能杀死病毒，但能钝化病毒的活性，使其增殖减缓或停止从而失去浸染能力。

②　在分裂细胞中，正常核蛋白合成占优势，而在细胞生长期间是病毒核蛋白的合成占优势。热处理可以加速植物细胞的分裂，抑制病毒繁殖。

6.无病毒植株脱毒程序（茎尖培养为例）

材料准备→生长点的分离和培养→无病毒植株的鉴定（血清鉴定法、生物鉴定法）→无毒原种苗的繁殖

五、植物特殊倍性创制

1.染色体组：遗传学上把二倍体生物一个正常配子中所含的全部染色体称为一个染色体组。

2.整倍体（多倍体、单倍体）：体细胞含有完整染色体的类型。

3.非整倍体（超倍体、亚倍体）：染色体组内个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的完整倍数。

4.多倍体（polyploid）：指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体。

(1)同源多倍体：是指增加的染色体组来自同一物种，一般是由二倍体的染色体直接加倍得到的。

(2)异源多倍体：是指增加的染色体组来自不同物种，一般是由不同种属间的杂交种染色体加倍形成的。

5.多倍体的产生途径：

(1)自发形成。

(2)人工诱发体细胞染色体数加倍。

(3)秋水仙素处理分身组织，阻碍分裂细胞纺锤丝的形成。

6.染色染色体工程：是人们按照一定的设计，有计划地削减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。（广义上讲，染色体工程还包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称作染色体操作技术。）

7.人工诱导多倍体的方法：

(1)生物学方法：胚乳培养、体细胞杂交、种间杂交。

(2)物理学方法：温度休克法、水静压法、高盐高减法。

①　温度休克法：冷（1-5℃）、热（30℃左右）；关键：能否成功地阻止第二次成熟或第二极体的排出。

(3)化学方法：细胞松弛素B、秋水仙素。

核体积测量法

蛋白质电泳

间接法生化分析

形态学检查

8.多倍体的鉴定方法：

染色体计数

直接法

DNA含量测定

9.多倍体的应用

①　克服远缘杂交的不孕性。

②　克服远缘杂交的不实性。

③　创造种间杂交育种的中间亲本：实质是克服远缘杂交不育性。

④　人工合成新物种、育成植物新类型，人工合成同源多倍体、异源多倍体。

10.单倍体：具有配子染色体数目的个体。

11.单倍体的优点：

①　只有一套染色体，每个基因都能得到表现，较易发生突变，变异当代便可表现出来，便于早期识别选择；

②　快速得到纯合体，缩短育种年限，提高育种效率；

③　合成育种新材料。

12.单倍体产生的途径

①　孤雌生殖、无配子生殖：延迟花粉、辐射处理花粉、化学诱导、利用远缘花粉授粉。

②　染色体有选择地消失。

③　离体培养：花药（花粉）培养；未授粉子房、胚珠培养。

13.花药培养：是指未成熟的花药接种在人工培养基上分化为植株的过程。（花药是一个植株上的器官，属于器官培养；花粉是一个单细胞，属于细胞培养。）

14.雌核发育（gynogenesis）：俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。

15.精子遗传物质的失活

①　物理方法：γ射线、X射线（具有较高的穿通能力，其主要作用是诱使染色体断裂，因而对精子的存活有一定影响）；紫外射线（诱使胸腺嘧啶二聚化）。

②　化学方法：甲苯胺蓝、乙烯尿素、二甲基硫酸

③　显微手术法

细胞分裂的失活

16.雌核发育（androgenesis）：是指因经过紫外线、x射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，抑制第一次卵裂，使进入卵子内的染色体加倍，而发育成为完全表现父本遗传性状的二倍体。

17.染色体转移技术：又称为染色体转导，是指把同特性基因表达有关的染色体或染色体片段转入到受体细胞中，使之能得以表达，并能在细胞分裂中一代一代传递下去的技术。

18.主要方法：微细胞介导的基因转移法，染色体介导转移法。

19.微细胞：只有一条或几条染色体和一层薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。

20.染色体介导转移法的基本步骤：

①　使细胞分裂同步，阻断细胞分裂于中期；

②　破碎细胞，离心收集中期染色体；

③　通过适当的分类转移至受体细胞中。

21.真核细胞的染色体的关键序列：着丝粒、端粒、自主复制序列。

22.微细胞的制备：利用秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分裂中期，在染色体周围逐渐形成核膜而成为众多微核，然后用细胞松弛素B处理微核突出细胞膜外，经过离心获得微细胞。

23.微细胞融合：以微细胞做供体，通过与遗传性完整的受体细胞融合，可以将微细胞内所含有的几条染色体转移到受体细胞中去。

六、植物细胞培养与次生产物生产

1.植物次生代谢物（plantsecondarymetabolite）：是指植物生活细胞的次生代谢产生的，大多对生物体代谢没有什么明显功能，但却对生物体具有选择性优势的一类化合物。

2.次生代谢物或次生产物是由糖类、脂肪、氨基酸等初级产物的代谢衍生出来的，一般储藏在液泡或细胞壁中，为代谢的终产物，大多不参与代谢活动。

3.植物细胞规模培养技术要点：

(1)细胞系的建立和选择：悬浮细胞系→单细胞培养与筛选→种细胞增殖

(2)优良细胞系的增殖培养

(3)大规模培养体系的建立：一步法逐渐放大（对于细胞生长与目的产物合成同步的类型）；两步法。

(4)提高细胞次生代谢产物的途径：

①　明确植物细胞生长与产物合成的关系：生长偶联型（产物合成与细胞生长成正比）；中间型（产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成）；非生长偶联型（产物合成在细胞生长停止后）。

②　选择适宜的起始材料。

③　选择合适的培养基成分：一般来说，N、P、K能促进细胞生长，则糖浓度有利于次生代谢产物的合成。

④　激发子的应用。

a.激发子：也称诱导子，是指能够诱导植物细胞代谢途径或强度改变，并促使形成细胞特征自身防御反应的分子。

b.非生物激发子：作为植物细胞的胁迫因子，使植物通过生产特定的次生代谢途径或产物作出防御性应答反应。

c.生物激发子：外源激发子，多来源于微生物；内源激发子来源于植物本身的物质，如细胞碎片、寡聚糖等。

4.原生质体培养：植物除去细胞壁后分离得到的裸露的球形细胞部分。利用原生质体可以进行细胞融合，摄取外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。

5.原生质体培养的特点及用途：

(1)特点：

①　无细胞壁，可方便的进行细胞膜和细胞器研究；同时也为植物细胞的遗传转化提供了有利条件。

②　具有全能性，可通过原生质体培养获得再生植株。

③　通过原生质体融合可形成杂种细胞，为创造新品种集种质资源材料提供了途径。

④　是体细胞诱变育种的良好材料。

(2)用途

①　提供相关生理生化研究的材料；

②　利用原生质体可以摄取病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等外源物质的特点，而被用作研究基因表达和调控、遗传工程研究的材料；

③　原生质体融合可改变遗传物质，建立杂交品种；同时还可以用于研究染色体行为、基因定位等；

④　用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传实验。

6.原生质体的发育和植株再生：

①　细胞壁再生

②　细胞分裂

③　愈伤组织或胚状体的形成

④　植株的再生：诱导胚状体；愈伤组织诱导

7.原生质体的分离与培养技术路线：材料准备→预处理→酶解→收集纯化→活性检测→培养→细胞壁再生→细胞团→愈伤组织→愈伤分化→植物再生。

七、原生质体培养

1.细胞融合（cellfusion）：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的技术。

2.细胞融合的意义：

①　克服远缘有性杂交的不亲和性：如马铃薯和番茄、甘蓝和白菜。

②　创造细胞质杂种：转移细胞质控制的性状，实现双亲细胞质的融合。

③　为携带外源遗传物质（信息）的大分子渗入细胞创造条件。

④　利用细胞融合技术观察蛋白质运动，意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。

3.细胞融合的主要方法及特点：

(1)生物法——仙台病毒法：仙台病毒使两种不同的动物细胞之间发生凝结，进而融合成一体。仙台病毒促使细胞融合的因素与病毒被膜上的磷脂成分有关，而与病毒内核酸的活性无关。

(2)化学融合法：用化学物质作为诱导剂，促使原生质体聚集、粘连和融合的方法。

①　盐类融合剂：硝酸钠/钾/钙等。

②　多聚物融合剂：多聚赖/鸟氨酸、聚乙二醇（PEG）：PEG促融效果好，而且对原生质体的伤害小。

③　其他化合物：ATP、ADP、葡萄糖硫酸盐等。

(3)物理法——电融合法：

①　交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。高频直流脉冲使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

②　与PEG比较：不存在对细胞的毒害问题；融合效率高，技术操作简便。

4.同核体：同源原生质体的融合体。

5.异核体：非同源的原生质体的融合体。

6.植物融合细胞筛选方式：

(1)遗传互补筛选法；利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，从而令杂种细胞表现正常。

(2)抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。

(3)物理特性筛选法：根据亲本原生质体的大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率形成的愈伤组织的差异等筛选杂种细胞。

(4)生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。

7.动物细胞的筛选方式：

(1)利用抗药性筛选

(2)营养互补筛选

(3)温度敏感突变型杂种细胞的筛选

8.细胞融合技术的具体操作过程：植物原生质体分离→原生质体纯化→原生质体融合→杂种细胞的筛选→细胞壁再生→愈伤组织形成、器官分化→杂种植物鉴定。

9.单克隆抗体生产：

(1)抗原：外源性、结构性、特异性

(2)血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。

10.单抗的制备过程：

①　亲本细胞的选择

②　细胞融合

③　杂交瘤细胞筛选

④　杂交瘤细胞的克隆化培养

⑤　单抗的大规模生产

11.细胞融合技术的进展与展望：

①　不对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。

②　胞质杂种：去掉核后的细胞质与另外一个完整细胞融合形成的杂种。

八、人工种子

1.人工种子：

①　狭义：指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。

②　广义：是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳后），用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。

2.人工种子的结构海藻酸盐

①　人工种皮：胶囊式结构+Ca(NO3)2蛰合物

②　体细胞胚

③　人工胚乳：碳源、蛋白质、矿质元素、抗生素、亲水剂、生长调节物质。

④　体细胞胚：由组织培养中获得的体细胞及胚状体、愈伤组织、原球茎、不定芽、顶芽、腋芽、小鳞茎等繁殖体组成。

3.人工种子的分类：

①　裸露的或休眠的繁殖体，

②　人工种皮包被的繁殖体，

③　水凝胶包埋再包被人工种子的繁殖体。

4.人工种子的意义：

①　在无性繁殖植株植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有生苗的复壮效应。

②　可以对优异杂交种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义。

③　对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料，如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用。

④　与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险。

⑤　与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。

5.人工种子的局限性：

①　储藏困难

②　成本较高

③　体细胞无性系变异。

6.人工种子制备的技术要点：

①　胚状体的收集

②　胚状体的同步化（过筛法、密度梯度离心法）

③　营养液的配制

④　包埋剂的选择（褐藻酸钠、琼脂糖等）

⑤　种皮的制备

⑥　胚状体的包埋

⑦　人工种子的保存

7.包埋的方法：液胶包埋法、干燥包埋法、水凝胶法。

九、动物细胞工程概述

1.动物细胞：①无细胞壁

②倍增时间长，生长缓慢

③需氧量少，对搅拌敏感

④原代细胞培养50代即开始退化

2.动物细胞与组织培养：从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

3.优点：⑴理化环境可以控制。

⑵细胞经培养后形成的细胞系和细胞株特征均一。

⑶培养物可直接被观测。

⑷提供大量均一的细胞供制备用。

⑸便于进行人工筛选。

⑹可观察细胞代谢活动和反应。

(7)广泛应用于病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学、分化及发育、细胞毒理试验及生物技术等各个领域。

4.原代培养（primaryculture）：又称初代培养，是指将机取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增值10代左右，这样的细胞称为原代培养。

5.传代培养（passageculture）：从原代培养的细胞继续转接培养。

6.细胞系：由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群称作细胞系。

7.体外培养细胞根据形态特征及生长方式分为：

①　贴附型细胞：细胞与细胞，细胞与细胞外基质结合（成纤维细胞壁、上皮、游走、多形）

②　非贴附型细胞：体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。

8.悬浮培养（suspensionculture）：指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统。小规模的悬浮培养可在培养瓶中进行；大规模的需要利用生物反应器生产。悬浮培养分为两种类型：分批培养和连续培养。

9.体外培养细胞的特点：

①　贴附

②　接触抑制

③　密度抑制

10.接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于繁殖数量增多，相互接触后不再增加。

11.细胞系的生长过程：原代培养期、传代期、衰退期。

12.细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。

13.每代细胞的生长过程：潜伏期、指数生长期、稳定期、衰退期。

14.动物细胞培养必需的溶液：

①　平衡盐溶液（BSS）：生理盐水和葡萄糖制成。

用途：洗涤组织细胞；配制各种培养用液的基础溶液；维持渗透压；提供缓冲系统；提供水分和无机盐。大多数平衡盐溶液内附加的葡萄糖可以提供细胞生存所需的能量。

②　细胞消化液：胰蛋白酶、EDTA及胶原酶溶液。

③　培养基pH值调整液：HEPES离子缓冲剂：碳酸氢钠溶液

④　抗生素液：防止微生物污染。

十、动物细胞工程概述

1.胚胎工程（embryonicengineering）：是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产和临床上具有广泛的应用，它主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等。

2.胚胎工程技术：胚胎移植、超数排卵、胚胎分割、胚胎嵌合、性别控制、体外受精、细胞核移植、胚胎冷冻保存。

3.意义：

①　充分发挥优良母畜的繁殖能力，加快优良品种的改良。

②　胚胎移植是胚胎操作的基础。

③　结合冷冻胚胎技术，能长期保存珍贵的遗传资源和便于运输。

4.人工授精：又称之为体外受精（IVF），就是将哺乳动物的卵母细胞从母体取出后，在体外进行精卵结合的过程。

5.由于体外受精在实验室进行，所以得到的动物或人称为试管动物或试管婴儿。

6.胚胎移植：又称为受精卵移植，是指将一头雌性动物（共体）的早期胚胎从其生殖道中（输卵管或子宫）取出后，或者体外培养受精卵发育至囊胚期，然后将它们移植到另一头同期发情的雌性动物（受体）的相应部位，使其在受体的子宫内继续生长发育，直至产下共体的后代，又俗称借腹怀胎。

7.胚胎移植的关键技术：

①　供体和受体的选择

②　超数排卵

③　发情同步化

④　胚胎的收集

⑤　胚胎的检查

⑥　胚胎的保存与培养

⑦　胚胎的移植

⑧　供体和受体的术后观察

8.超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵。

9.胚胎分割：是指借助显微镜操作技术或徒手操作技术，将早期胚胎切割成2、4等多份，再移植给受体母育，从而制造出同卵多仔后代的技术。

10.胚胎分割的意义：

①　可以使胚胎数目成倍增加，可以生产出遗传背景相同的后代

②　是扩大胚胎利用率的一条有效途径，是一种广义意义上的克隆

③　应用胚胎分割可以控制性别

11.胚胎融合：又叫胚胎融嵌合，是指把两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。

12.胚胎融合的意义：

①　可以作为研究和分析哺乳动物发生机制的重要手段

②　通过嵌合体中的白细胞了解正常个体的防疫机理等。通过嵌合体建立人类疾病模型，特别是遗传病的研究分析等

③　通过嵌合体技术可以培育杂种个体，甚至是种间杂种

13.试管动物：将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后发育到一定程度的胚胎移植入受体得到的各种动物。由于体外受精一般都在试管内进行，所以称为试管动物，也有称体外受精动物。

14.试管动物的培育流程：

①　精子的采集与体外获能处理。

②　卵子的回收与成熟培养。

③　卵子与精子的体外受精。

④　受精卵的体外发育。

⑤　试管胚胎的移植。

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